Na condição de representante de armadores florentinos, o mercador e navegador Vespúcio encarregou-se em Sevilha do aprovisionamento de navios para a segunda e a terceira viagens de Cristóvão Colombo.
Supõe-se que tenha participado de incursões pelo Atlântico desde 1497. Em 1499, acompanhou Alonso de Ojeda numa expedição que alcançou a costa americana acima do rio Orinoco.
Em 1501, participou de outra armada, sob o comando de André Gonçalves, encarregada de explorar a costa brasileira. Saindo de Lisboa, em 17 de agosto a frota alcançou o cabo de São Roque, provavelmente descendo a costa até a Patagônia.
Em 1503, Vespúcio retornou ao Brasil, desta vez comandando um navio da frota de Gonçalo Coelho, armada por cristãos-novos associados a Fernão de Noronha. Perdendo-se do resto da armada, carregou o navio de pau-brasil ao sul da baía de Todos os Santos e desembarcou em Lisboa em 18 de junho de 1504.
No ano seguinte, em Sevilha, naturalizou-se espanhol e, de 1508 até sua morte, foi o piloto-mor da Casa de Contratação das Índias.
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